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              豬藍耳病毒RT-PCR檢測試劑盒

              產品編號:SP002

              檢測方法:普通PCR 檢測

              檢測樣品:血液或組織

              規格:25T/50T


                

              豬藍耳病毒RT-PCR檢測試劑盒




              【產品名稱】

              通用名稱:豬藍耳病毒RT-PCR檢測試劑盒

              英文名稱:Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus RT-PCR Detection Kit

              【包裝規格】 10 T/ 50 T/

              【預期用途】

              本試劑盒適用于豬藍耳病毒檢測,可用于臨床豬藍耳病毒感染的輔助診斷,但不作確診使用。

              【檢驗原理】

              利用離心柱內硅基質膜提取RNA,在反轉錄酶的作用下,以RNA為模板,以引物為起點合成與RNA模板互補的cDNA鏈。在TaqDNA聚合酶的作用下,經高溫變性、低溫退火、中溫延伸的循環,使特異DNA片段的拷貝數放大一倍。經過35次循環,最終使擴增DNA片段放大了數百萬倍。將擴增DNA片段進行電泳,經染色后,在紫外燈照射下,肉眼可見到DNA片段的擴增帶。

               

              【主要組成成份】

               

              組成

              10T/

              50T/

              PRRSV RT-PCR反應液

              150 μL×1

              750 μL×1

              PRRSV 混合

              30 μL×1

              150 μL×1

              PRRSV 陽性對照

              40 μL×1

              40 μL×1

              PRRSV 陰性對照

              40 μL×1

              40 μL×1

              0.2 mL薄壁PCR

              12

              60

              50TAE電泳緩沖液(50倍稀釋后使用)

              20 ml

              100 ml

              染色液

              20 μL

              50 μL

              上樣緩沖液

              40 μL

              200 μL

              制備管

              10

              50

              2 ml 離心管

              20

              100

              1.5 ml 離心管

              10

              50

              Buffer V-L(病毒裂解液)

              2.4 ml

              12 ml

              Buffer V-N(蛋白去除液)

              0.8 ml

              4 ml

              Buffer W1A concentrate(洗滌液)

              4.8 ml

              24 ml

              Buffer W2 concentrate(去鹽液)

              4.8 ml

              24 ml

              Buffer TEnuclease-free

              0.8 ml

              4 ml

              說明書

              1

              1

              注:陰性對照為豬基因組DNA,陽性對照為失去活性的豬藍耳病毒cDNA。

               

              【儲存條件及有效期】-20℃以下保存,避免反復凍融,有效期12個月。

               

              【需自備的物品】

              1.儀器:分析天平、離心機、PCR擴增儀、電泳儀、電泳槽、紫外凝膠成像儀(或紫外分析儀)、微波爐、-20 ℃冰箱、可調移液器(2 μL、20 μL、200 μL、1000 μL)。

              2.耗材:眼科剪、眼科鑷、稱量紙、20 mL一次性注射器、生理鹽水、瓊脂糖、500 mL量筒、500 mL錐形瓶、經焦碳酸二乙酯(DEPC)水處理的滅菌1.5mL離心管和吸頭(10 μL、200 μL、1000 μL)、滅菌雙蒸水。

               

              【注意事項】

              1.病毒具有很強的感染能力,操作前必須準備好各種防御措施。

              2.操作時須嚴格按照步驟進行,廢物必須放入含消毒液的廢物缸,以免污染實驗室和工作人員。

              3.為避免其他核酸的污染而出現假陽性,必須使用不含DNARNA的離心管、吸管、槍頭、試劑和手套,操作人員須戴口罩。

              4.Buffer V-L、Buffer V-NBuffer W1A含刺激性化合物,操作時要戴乳膠手套和眼鏡,避免沾染皮膚、眼睛和衣服,謹防吸入口鼻。

               

              【實驗準備】

              第一次使用時,請在Buffer W1 ABuffer W2 concentrate中按試劑瓶上指定的體積加入無水乙醇;

              準備異丙醇(1%冰乙酸):即99ml異丙醇中加入1ml冰乙酸,混合均勻,室溫密閉儲存;

              如果是提取病毒RNA,請選用RNase free Tip槍頭和1.5 ml離心管或將槍頭和離心管用0.1% DEPC水處理后再使用。

               

              【操作步驟】

              1.樣本要求:

              (1) 血液或血清樣品:使用無菌注射液抽取樣品置于離心管中待檢。

              (2) 肌肉或內臟樣品(如肺臟、脾臟、淋巴結):取樣本20 g,加少量滅菌PBS,用無菌研磨器研磨至糊狀,再用4倍體積的PBS稀釋成乳劑,8000 rpm 4℃離心10 min,取上清待檢。

              (3) 應避免標本間交叉污染。

              (4) 標本收集后可立即檢測;若不能立即檢測,可置于28℃冷藏過夜保存;如需長期保存,標本應凍存于-80℃以下,避免反復凍融。

              2. 樣品處理:每份樣品分別處理。

              1)無細胞體液樣品處理:收集200 μL樣品,轉入到1.5 ml離心管中;

              2)全血樣品處理:待血凝后取血清 200 μL , 轉入到1.5 ml離心管中;

              3)組織樣品處理:每份組織分別從三個不同的位置稱取樣品約 1g ,用手術剪碎混勻后取 ,用手術剪碎混勻后取 0.05 g于研磨器中,加入1.5 mL生理鹽水繼續充分研磨,待勻漿后轉至1.5 mL 滅菌離心管中,12,000 rpm離心 5 min,取上清液 200 μL 1.5 mL離心管中。

              3. 提取過程:

              1)向上一步轉入樣品的1.5 mL的離心管中,加入200 μL Buffer V-L,渦旋振蕩混合均勻,靜置5 min。

              2)加入75 μL Buffer V-N,渦旋振蕩混合均勻后,于12,000 rpm離心5 min。

              3)將上清液轉移到新的2mL離心管(試劑盒內已提供)中,加300 μL異丙醇(1%冰乙酸),上下倒置6-8次,混合均勻。

              4)將制備管置于2ml離心管(試劑盒內提供)中,取上一步驟中的混合液移入制備管中,6,000 rpm離心1 min。

              5)棄濾液,將制備管放回到2 ml離心管中,加入500 μL Buffer W1A(確認已按要求加入無水乙醇),室溫靜置1min,于12,000rpm離心1 min。

              6)棄濾液,將制備管放回到2 ml離心管中,加入800 μL Buffer W2(確認已按要求加入無水乙醇),于12,000 rpm離心1 min。

              7)將制備管放回到2 ml離心管中,12,000 rpm離心1 min。

              8)將制備管置于潔凈的1.5 ml離心管(試劑盒內已提供)中,在制備管膜中央加入40-60 μL Buffer TEnuclease-free),室溫靜置1min,于12,000rpm離心1-2min洗脫DNA/RNA。

              注:洗脫體積越大,洗脫效率越高。如果需要DNA/RNA濃度較高,可以將洗脫的DNA/RNA再次過柱離心洗脫一次;或適當減少洗脫體積, 但是最小體積不應少于30 μl,體積過小降低洗脫效率,減少RNA產量。

              4. RT-PCR擴增

              每份總體積20 μL,含15 μL RT-PCR反應液(用前混勻),3μL 混合酶液,2 μL模板RNA。

              例如:n份樣品,配制n+1份,15×n+1RT-PCR反應液, 3×n+1)混合酶液勻后取18 μL分裝成n份,分別加入2 μL模板RNA,作好標記。

              PCR擴增儀上進行以下程序:50 ℃ 10 min,94 ℃ 3 min;循環94℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,共35次;再72 ℃延伸7 min。

              5. 電泳

              1.5 g瓊脂糖放于500 mL錐形瓶中,加入50倍稀釋的TAE電泳緩沖液100 mL(取2 mL 50TAE電泳緩沖液,用雙蒸水稀釋至100 mL),于微波爐中熔解,再加入50 μL染色液混勻。在電泳槽內放好梳子,倒入瓊脂糖凝膠,待凝固后將PCR擴增產物10 μL點樣于瓊脂糖凝膠孔中,以110120V電壓于50倍稀釋的TAE電泳緩沖液中電泳,紫外燈下觀察結果。

               

              【結果判定】

              陽性對照出現160 bp擴增帶、陰性對照無帶出現(引物帶除外)時,實驗結果成立。被檢樣品出現160bp擴增帶;結果判讀160bp擴增帶為豬藍耳病毒陽性,否則為陰性。

                               


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