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              貓皰疹病毒I型檢測試劑盒(實時熒光PCR法)

              產品編號:SP008

              檢測方法:熒光PCR

              檢測樣品:眼,鼻式子

              規格:25T/50T


                

              貓皰疹病毒I型檢測試劑盒(實時熒光PCR法)




              【產品名稱】

              通用名稱:貓皰疹病毒I型檢測試劑盒(實時熒光PCR法)

              英文名稱:Feline Herpesvirus Detection Kit (Real-Time PCR Method)

              【包裝規格】 25T/ & 50T/

              【預期用途】

              貓皰疹病毒I型?。?/span>Feline Herpesvirus I,FHV-1,又叫貓鼻氣管炎病毒是由貓皰疹病毒I型(FHV-1)引起的貓呼吸道感染等疾病。本試劑盒利用實時熒光PCR原理,主要用于貓皰疹病毒I型的定性篩查檢測及療效評估有重要指導意義。

              【檢驗原理】

              本試劑盒針對貓皰疹病毒I型基因設計特異性引物和分子信標探針,在待檢樣本中含有貓皰疹病毒IDNA的情況下,PCR反應得以進行并釋放熒光信號。利用儀器對PCR過程中相應熒光信號進行實時監測和輸出,實現檢測結果的定性分析。

              【主要組成成份】

              序號

              組成

              25T/

              50T/

              1

              FHV-1 PCR反應液及混合酶液

              20 μL×25

              20 μL×50

              2

              FHV-1 陰性對照

              40 μL×1

              40 μL×1

              3

              FHV-1 陽性對照

              40 μL×1

              40 μL×1

              4

              說明書

              1

              1

              注:陰性對照為不含貓皰疹病毒I型的其它菌的混合物,陽性對照為滅活的貓皰疹病毒I型。

              【儲存條件及有效期】避光-20℃以下保存,避免反復凍融,有效期12個月。

              【適用儀器】ABI 系列、Bio-Rad系列、Agilent Stratagene MX系列、Roche LightCycler R480、Cepheid SmartCycler、Rotor-Gene系列、杭州博日系列等多通道實時熒光定量PCR儀。

              【樣本要求】

              1. 采集貓的咽喉拭子、眼睛、鼻分泌物或潰瘍傷口等作為樣本,咽喉拭子用少量生理鹽水浸潤后取上清待檢;其他樣品加等體積生理鹽水研磨勻漿,3000 g離心15 min,收集上清待檢

              2. 如需在增菌后進行PCR檢測,則應使用選擇性增菌液對原始標本進行增菌。

              3. 標本收集后若不能立即檢測,可置于28℃冷藏過夜保存;如需長期保存,標本應凍存于-20℃-80℃。

              【檢驗方法】

              1. 試劑準備(試劑準備區)

              a.計算當次實驗所需要的反應數,從-20℃以下冰箱保存的試劑盒中取等量8PCR反應管(內裝有PCR反應液及混合酶液),平衡至室溫;預留一管作為陰性對照一管作為陽性對照。

              b.將實驗所需的8PCR反應管轉移至樣本處理區。

              2.樣本準備(樣本處理區)

              QIAGEN、Roche公司DNA提取試劑盒提取DNA,具體操作按照其試劑盒說明書操作?;虬匆韵路椒ú僮鳎?/span>

              a.取試劑準備區傳遞過來的DNA提取液,2000 rpm 離心10 s后備用。

              b.取樣本自然沉降后的上清液1 mL,加入到1.5 mL無菌離心管中,12000 rpm離心5 min后,吸干上清,保留沉淀。

              c.每管沉淀中加入DNA提取液50 μL,將沉淀懸浮后100℃加熱處理5 min。

              d.12000 rpm離心2 min,取上清用于PCR檢測。

              3.加樣

              a.取出8PCR反應管試劑,瞬時離心以去除管壁附著液體。

              b.打開反應管管蓋,在液封層上(切勿插入底部)加入5 μL處理好的樣本重懸液;陰性對照和陽性對照管則各加5 μL陰性對照或陽性對照品;

              c.蓋好PCR反應管蓋,瞬時離心以去除管壁附著液體。

              d.記錄模板加樣順序。將PCR反應管轉移到PCR擴增區進行PCR檢測。

              4.PCRPCR擴增區)

              1)取樣本處理區準備好的PCR反應管,放置在實時熒光定量PCR儀樣品槽相應位置,并記錄放置順序。

              2)按下表設置儀器核酸擴增相關參數進行PCR擴增。

               

              反應體積

              25 μL

              通道選擇

              FAM通道采集貓皰疹病毒I型熒光信號

              PCR

              反應

              條件

              步驟

              條件

              循環數

              UNG處理

              50℃2分鐘(min

              1

              預變性

              95℃3分鐘(min

              1

              預擴增

              95℃5秒(s

              5

              55℃40秒(s

              PCR擴增

              95℃5秒(s

              40

              55℃40秒(s

              (此階段結束時采集熒光信號)

              注:ABI系列熒光PCR儀在設置時不選ROX校正,設置淬滅基團選擇None。

              【參考值(參考范圍)】

              1.試劑盒有效性判定:

              1)陽性對照:有典型S型擴增曲線或Ct≤35。

              2)陰性對照:Ct值>38或無Ct值,線形為直線或輕微斜線,無指數增長期。

              2.標本結果判定:

              1)陽性:標本檢測結果Ct≤35或有明顯指數增長期。

              2)可疑:標本檢測結果Ct值在3538范圍內。此時應對標本進行重復檢測,如重復實驗結果Ct值仍在3538范圍內,有明顯指數增長期,則判定為陽性,否則為陰性。

              3)陰性:標本檢測結果Ct值>38或無Ct值。

              【檢驗結果的解釋】

              通道及檢測結果

              標本檢測結果解釋

              FAM

              陰性(-)

              標本中未檢出貓皰疹病毒I

              陽性(+)

              標本中檢測出貓皰疹病毒I

              【檢驗方法的局限性】

              1. 當檢測樣本中被檢核酸濃度含量低于本試劑盒的最低檢出限時可能會發生假陰性的結果。

              2. 本試劑盒僅供標本初步篩查使用,對于本試劑盒檢測陽性結果應進一步使用培養法進行確診。

              【產品性能指標】 產品的最低檢出限為102CFU,產品CV≤5%。

              【注意事項】

              1. 整個檢測過程應嚴格按照本說明書要求分別在試劑準備區、樣本處理區和PCR擴增區進行操作,各區實驗服、儀器、耗材應獨立使用,不能混用;實驗用吸頭采用帶濾芯吸頭;樣本處理區應配有生物安全柜,樣本處理在生物安全柜中進行操作;三個區應該配有紫外線殺菌裝置。

              2. 每次實驗應該設置陰、陽性對照。

              3. 為保證試劑不受標本污染,必須將DNA提取液、混合酶液及PCR反應液保存于試劑準備區。

              4. 試劑盒所有試劑在使用前應該在常溫下充分融化混勻,并應瞬時離心。

              5. 試劑盒內所配陰性和陽性對照在第一次使用前應全部轉移至標本準備區,并單獨存放。

              6. 為防止熒光干擾,應避免裸手直接接觸PCR反應管,并應避免在PCR反應管上進行任何標記。

              7. 儀器擴增相關參數應按照本說明書相關要求進行設置;不同批號試劑不能混用。

              8. ABI系列熒光定量PCR儀參數設置中不選ROX校正,淬滅基因選擇None。

              9. 實驗過程中產品的廢棄物應該進行無害化處理后方可丟棄。

               


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